MTT原理

　　x09MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,汉语化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名：噻唑蓝.是一种黄颜色的染料.

　　x09MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法.其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中,而死细胞无此功能.二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量.在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比.该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等.它的特点是灵敏度高、经济.缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测.这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害.

　　MTT溶液的配制方法通常,此法中的MTT浓度为5mg/ml.因此,可以称取MTT0.5克,溶于100ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃避光保存即可.在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住.实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好.需要注意的是,MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数.在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT吸光度最好在0-0.7范围内.

　　x09MTT一般最好现用现配,过滤后4ºC避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解.我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了.

　　x09MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.

　　x09配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解.PBS配方：Nacl8g＋Kcl0.2g＋Na2HPO41.44g＋KH2PO40.24g调pH7.4,定容1L.

　　普通MTT法实验步骤：1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细

　　x09胞接种到96孔板,每孔体积200ul.2:培养细胞：同一般培养条件,培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）.3：呈色：培养3-5天后,每孔加MTT（噻唑蓝）溶液（5mg/ml用PBS配制,pH=7.4)20ul.继续孵育4h,

　　x09终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液.

　　x09每孔加150ulDMSO,振荡10min,使结晶物充分融解.4：比色：选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为

　　x09横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线.

　　药物MTT法实验步骤贴壁细胞：1:收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000-

　　x0910000孔,（边缘孔用无菌PBS填充）.2:5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上,

　　x09细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午

　　x09加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况3:5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察.4:每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT）,继续培养4h.若药物与MTT能够反应,

　　x09可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液.5:终止培养,小心吸去孔内培养液.6:每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解.在酶联免

　　x09疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值.7:同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）,对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介

　　x09质、培养液、MTT、二甲基亚砜）.

　　悬浮细胞：1:收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的1640（无血清）培

　　养基40ul；②加ActinomycinD（放线菌素D有毒性）10ul用培养液稀释(储存液100g/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔）,共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）.每板设对照（加100l1640）

　　2:置37℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察.3:每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT）,继续培养4h.（悬浮细胞推荐使用

　　WST-1,培养4h后可跳过步骤4）,直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）

　　x094、离心（1000转x10min）,小心吸掉上清,每孔加入100ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解.在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值.

　　x095、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜DMSO）,对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）,每组设定3复孔.

　　注意事项：(1)选择适当得细胞接种浓度.(2)避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验.在呈色后尽量吸尽孔

　　x09内残余培养液.(3)设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照.其他试验步骤保持一致,

　　x09最后比色以空白调零.

　　(4)MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系.

　　x09(5)用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适

　　x09根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于

　　x09DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定

　　x09(6)一般每孔4000个细胞为宜,既细胞浓度在20000个/ml,MTT加20ul,作用四小