1.基因突变

　　genemutation

　　由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或改变,而引起的基因结构的改变,就叫做基因突变.

　　1个基因内部可以遗传的结构的改变.又称为点突变,通常可引起一定的表型变化.广义的突变包括染色体畸变.狭义的突变专指点突变.实际上畸变和点突变的界限并不明确,特别是微细的畸变更是如此.野生型基因通过突变成为突变型基因.突变型一词既指突变基因,也指具有这一突变基因的个体.

　　基因突变通常发生在DNA复制时期,即细胞分裂间期,包括有丝分裂间期和减数分裂间期；同时基因突变和脱氧核糖核酸的复制、DNA损伤修复、癌变和衰老都有关系,基因突变也是生物进化的重要因素之一,所以研究基因突变除了本身的理论意义以外还有广泛的生物学意义.基因突变为遗传学研究提供突变型,为育种工作提供素材,所以它还有科学研究和生产上的实际意义.

　　2.目的基因的获得

　　一,逆转录法

　　逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNA,再反转录成cDNA,然后进行cDNA的克隆表达.

　　1,mRNA的纯化

　　mRNA的特点:3'末端含有一多聚腺苷酸组成的末端.

　　方法:亲和层析法

　　2,cDNA第一链的合成

　　一般mRNA都带有3'-polyA,所以可以用寡聚dT作为引物,在逆转录酶的催化下,开始cDNA链的合成.

　　用放射性探针法检测.

　　3,cDNA第二链的合成

　　以cDNA第一链为模板合成第二链.

　　4,cDNA克隆

　　用于cDNA克隆的载体有两类:质粒DNA和噬菌体.又将其分为表达型载体和非表达型载体.选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法,有利于目的基因的筛选.

　　cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法:

　　加同聚尾连接:在载体和cDNA的3'末端加上互补的同型多聚酶序列.

　　人工接头连接:所谓人工接头是指用人工合成的,连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断.

　　5,将重组体导入宿主细胞

　　6,cDNA文库的鉴定

　　7,目的cDNA克隆的分离和鉴定

　　(1)核酸探针杂交法

　　(2)免疫反应鉴定法

　　逆转录-聚合酶反应法.该方法是mRNA经逆转录合成cDNA第一链,不需再合成第二链,而是在特异引物的协助下,用PCR法进行扩增,特异地合成目的cDNA链,用于重组,克隆.

　　二,化学合成法

　　前提:较小的蛋白质或多肽的编码基因,必须知道目的基因的核苷酸排列顺序,或知道目的蛋白质的氨基酸顺序,再按相应的密码子推导出DNA的碱基序列.

　　操作:见书

　　限制:一,不能合成太长的基因.

　　二,人工合成基因时,遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难.

　　三,费用高

　　基因表达

　　基因表达是指结构基因在生物体中的转录,翻译以及所有加工过程.

　　基因表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动,即剪切下一个外源基因片断,拼接到另一个基因表达体系中,使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物.

　　一,宿主细胞的选择

　　宿主细胞应满足的要求:

　　分类:第一类为原核细胞,如大肠杆菌等;第二类为真核细胞,如酵母等.

　　1,原核细胞

　　(1)大肠杆菌:目前采用最多的原核表达体系.

　　(2)枯草芽孢杆菌

　　(3)链霉菌

　　2,真核细胞

　　(1)酵母:酿酒酵母应用广泛.

　　(2)丝状真菌

　　(3)哺乳动物细胞

　　二,大肠杆菌中的基因表达

　　1,载体

　　表达载体必须具备的条件:

　　(1)载体能够独立的复制

　　(2)具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记

　　(3)具有很强的启动子

　　(4)具有阻遏子

　　(5)有很强的终止子

　　(6)有翻译的起始信号

　　常用的表达载体:

　　(1)pBV220系统

　　(2)pET系统

　　2,影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素

　　(1)外源基因的拷贝数

　　(2)外源基因的表达效率

　　①启动子的强弱

　　②核糖体结合位点

　　③SD序列和起始密码子ATG的间距

　　④密码子组成

　　(3)表达产物的稳定性

　　(4)细胞的代谢负荷

　　(5)工程菌的培养条件

　　3,真核基因在大肠杆菌中的表达形式

　　(1)以融合蛋白的表达形式表达药物基因

　　由一段短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的蛋白质,称为融合蛋白.

　　(2)以非融合蛋白的形式表达药物基因

　　(3)分泌型表达蛋白药物基因

　　三,酵母中的基因表达

　　1,载体

　　(1)载体的复制序列包括YEp类,YRp类,YRp类和YIp类.

　　(2)克隆载体由于从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易,所以酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的.

　　(3)表达载体包括普通表达载体和精确表达载体.