A、稀释涂布平板法首先要将菌液进行一系列的梯度稀释，A正确；

　　B、稀释后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，B正确；

　　C、平板涂布后要将培养皿放在适宜的条件下培养让菌体进行繁殖，C正确；

　　D、在不同稀释度的菌液接种后，只有在一定的稀释度的菌液里，聚集在一起的微生物才能分散成单个细胞，从而能够在培养基表面形成单个菌落；如果稀释度过低，将不会形成单个菌落；如果稀释度过高，可能没有菌落生成，D错误．

　　故选：D．