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　　（2,4－二硝基苯肼法）

　　【实验目的】

　　1．熟悉维生素C的生理功能.

　　2．掌握食物中维生素C的提取和含量测定.

　　【实验原理】

　　维生素C是人类营养中最重要的维生素之一,是具有L-糖构型的不饱和多羟化合物,属于水溶性维生素.维生素C缺乏时会产生坏血病,因此,又称为抗坏血酸.维生素C分布很广,植物的绿色部分及许多水果(橘类、草莓、山楂、辣椒等)的含量更为丰富.

　　维生素C具有很强的还原性.易被氧化成脱氢维生素C.脱氢维生素C仍保留维生素C的生物活性,在动物组织内被谷胱甘肽等还原成维生素C.在pH>7.5时,脱氢维生素C易将其分子构造重新排列,使其内酯环裂开,生成没有活性的二酮古洛糖酸.维生素C、脱氢维生素C和二酮古洛糖酸合称为总维生素C.

　　食物中的总维生素C包括还原型和脱氢型两种形式.食物陈旧,贮存日久以及经过烹调处理的食物,其中有相当一部分维生素C成为脱氢型,此种形态的维生素C仍有85%左右的维生素C活性,所以对这类食物常常测定总维生素C.测定时须将样品中的还原型维生素C氧化成脱氢型维生素C.因脱氢维生素C和二酮古洛糖酸都能与2,4-二硝基苯肼作用生成红色的脎,脎的生成量与总维生素量成正比.于是将脎溶于硫酸,再与同样处理的维生素C标准液比色,可求出样品中的总维生素C的含量.

　　【器材和试剂】

　　1.器材

　　硏钵、恒温水浴、72型分光光度计、50m1容量瓶、刻度吸管、100m1锥形瓶.

　　2.试剂

　　（1）橘皮.

　　（2）9N硫酸：25m1浓硫酸(比重1.84)缓慢加入700m1蒸馏水中,冷却后稀释至1000mI.

　　（3）2%2,4-二硝基苯肼：溶解2g2,4-二硝基苯肼于100ml

　　4.5mol/L（9N）硫酸中,过滤.4℃保存.每次用前需再过滤,保存时间限于2周.

　　（4）85%硫酸：90m1浓硫酸(比重1.84)缓慢加入100mI水中.

　　（5）1%草酸溶液.

　　（6）10%硫脲：称取硫脲50g溶于1%500mI草酸中,4℃保存.保存期限2个月.

　　（7）活性碳:100g活性碳加入750ml

　　1mol/L(1N)盐酸回流1～2h,过滤,用蒸馏水反复洗涤活性碳至洗涤滤液中无Fe3+为止.然后置烤箱中110℃烘干冷却后置干燥器中备用.

　　（8）标准维生素C贮存液：精确称取维生素C100mg,以1％草酸溶解并定容至100m1,4℃保存.

　　（9）标准维生素C应用液：准确吸取标准维生素C贮存液1.0m1置100m1容量瓶中,用1%草酸溶液稀释至刻度,用时现配.

　　【操作步骤】

　　1．样品提取橘皮2g剪碎置硏钵中,按1%草酸10～15m1,硏磨5～10min,将提取液收集至50

　　m1容量瓶中,如此重复提取2～3次,最后加1%草酸至50m1.

　　2．氧化、脱色

　　取上述提取液约10m1置于干燥100m1锥形瓶中,加入活性碳0.5g,充分振摇1min后过滤,取约10m1标准液于另一干燥锥形瓶中,加入活性碳0.5g

　　,同法振摇、过滤.

　　3．显色：取试管3支,编号,按下表操作：

　　试剂空白标准测定

　　样品滤液（ml）2.5—2.5

　　标准滤液（ml）—2.5—

　　10%硫脲（ml）111

　　2%2,4—二硝基苯肼(ml)01.01.0

　　混匀,置沸水浴中保温10min取出,流水冷却,空白管加2%2,4—二硝基苯肼1ml.

　　4．脎的溶解

　　各管置冷水浴中缓慢加入85%硫酸3.0m1,边加边摇边冷却.加完后混匀,取出试管,室温下放置10min,于500nm波长下进行比色,以空白管凋零,测吸光度值.

　　【计算】

　　【附注】

　　（1）生蔬菜、水果捣匀浆时可能产生泡沫,为定容准确可加数滴戊醇以除去泡沫.

　　（2）处理活性炭时Fe3+检查法：取活性炭洗涤滤液少许,加数滴5%亚铁氯化钾,若不出现蓝色,示无Fe3+；或加数滴1%硫氰酸钾,若不出现红色,也示无Fe3+.