氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力

　　一、原理

　　超氧物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶.本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小.在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收.而SOD可清除O2,从而抑制了甲腙的形成.于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高.据此可以计算出酶活性大小.

　　二、材料、仪器设备及试剂

　　（一）材料；水稻或小麦叶片

　　（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支.

　　（三）试剂

　　1.0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）；

　　2.130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；

　　3.750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存；

　　4.100μmol/LEDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；

　　5.20μmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存.

　　三、实验步骤

　　1.酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定,去叶脉）0.5g于预冷的研钵中,1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml.取1.2ml于1000rpm下离心20min,上清液即为SOD粗提液.

　　2.显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750μmol/LNBT溶液0.375μmol/L100μmol/LEDTA－Na2液0.310μmol/L20μmol/L核黄素0.320μmol/L酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处,其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长）.

　　3.SOD活性测定与计算至反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其它各管的吸光度.

　　四、结果计算

　　已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性.SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)

　　上式中,SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重.