A、基因工程中，为了使目的基因和质粒的连接，一般使用相同的限制性内切酶处理，A正确；

　　B、基因工程的工具酶只有限制酶和DNA连接酶，构建重组质粒时必需的工具酶是DNA连接酶，B错误；

　　C、用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了质粒或重组质粒，是利用了质粒上有标记基因（即抗生素抗性基因），C正确；

　　D、即使目的基因导入受体细胞，也不一定能复制、转录、翻译（表达），所以基因工程的最后步骤才是目的基因的检测与鉴定，如果导入就能表达就不需要最后这一步了． D正确．

　　故选：B．