荧光素酶（英文名称：Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称,其中最有代表性的是一种学名为Photinuspyralis的萤火虫体内的荧光素酶.在相应化学反应中,荧光的产生是来自于萤光素的氧化,有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷（ATP）.没有荧光素酶的情况下,萤光素与氧气反应的速率非常慢,而钙离子的存在常常可以进一步加速反应（与肌肉收缩的情况相似）.[1]荧光生成反应通常分为以下两步：

　　萤光素+ATP→萤光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+PPi

　　萤光素化腺苷酸+O2→氧荧光素+AMP+光

　　这一反应非常节省能量,几乎所有输入反应的能量都被转化为光.与之形成鲜明对比的是人类使用的白炽灯,只有越10%的能量被转化为光,剩余的能量都变为热能而被浪费.

　　荧光素或荧光素酶不是特定的分子,而是对于所有能够产生荧光的底物和其对应的酶的统称,虽然它们各不相同.不同的能够控制发光的生物体用不同的荧光素酶来催化不同的发光反应.最为人所知的发光生物是萤火虫,而其所采用不同的荧光素酶与其他发光生物如荧光菇（发光类脐菇,Omphalotusolearius）或许多海洋生物都不相同.在萤火虫中,发光反应所需的氧气是从被称为腹部气管（abdominaltrachea）的管道中输入.一些生物,如叩头虫,含有多种不同的荧光素酶,能够催化同一荧光素底物,而发出不同颜色的荧光.萤火虫有2000多种,而叩甲总科（包括萤火虫、叩头虫和相关昆虫）则有更多,因此它们的荧光素酶对于分子系统学研究很有用.目前研究得最透彻的荧光素酶是来自Photinini族萤火虫中的北美萤火虫（Photinuspyralis）.

　　虫荧光素酶luciferase

　　亦称发光酶.是催化生物发光的酶系的总称.它是光物质的冷水抽提物在氧中发光时,底物虫荧光素被消耗以后残余的对热不稳定的高分子成分.现在对萤虫相海萤以及发光细菌的虫荧光素酶结晶物的研究得最多.它们属于加氧酶（oxygenase）,不含金属和辅酶.对于发光,有的酶必须以ATP等作为辅助因子,有的则不需要.其发光机制等已了解到可因种的不同而有很大的差异,虫萤光素酶具有高度的特异性,一般仅作用于来自近缘种的虫荧光素.当然,萤虫、海萤的酶是不能互相代替引起发光的.海萤的虫荧光素酶在干燥状态下相当稳定,可以保存

　　双荧光素酶报告基因测试∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术

　　在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素.但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异.Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试.双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便.系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品.对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员.双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利.

　　介绍

　　双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测,通常一个报告基因作为内对照,使另一个报告基因的检测均一化.检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞,带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体.通常实验报告基因偶联到调控的启动子,研究调控基因的结构和生理基础.报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关,偶联到组成型启动子的第二个报告基因,提供转录活力的内对照,使测试不被实验条件变化所干扰.

　　通过这种方法,可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性,比如,培养细胞的数目和活力的差别,细胞转染和裂解的效率.

　　使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT),β-半乳糖苷酶(β-Gal),或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用.但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势,比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行,但CAT,β-Gal和GUS测试法,则在定量前需要长时间的保温.另外,这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围,必须注意不要超过这些范围,内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用.许多类型的细胞有内源β-Gal或GUS表达,不利于准确定量报告基因表达,胞内去乙酰酶活力干扰CAT活力测试.尽管在高温下预处理细胞裂解液(1,2),会降低内源性β-Gal和CAT测试的干扰,但这些处理也会快速失活荧光素酶.因此,在此类双报告基因检测中,必须以不同的步骤分别处理共转染的细胞裂解液.

　　理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定.这在传统的报告基因,如CAT,β-Gal和GUS是不可能的,由于它们测试化学,处理要求所固有的局限.相反,结合萤火虫(Photinuspyralis)和海洋腔肠(Renillareniformis)双荧光素酶,Promega的双荧光素酶报告基因测试(DLR)系统可满足这些要求,在单管中完成这些测试.

　　双荧光素酶报告基因测试化学

　　荧火虫和海洋腔肠荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的测试特点,但它们在进化上的起源不同,因此,具有不同的酶学结构和底物要求.这些差别用来发展了DLR测试化学,选择性地区别这两种发光报告基因的活力.萤火虫荧光素酶是一个61kDa单亚基蛋白质,酶活力不需翻译后修饰(3,4),在翻译后即可作为遗传报告基因.在ATP,Mg2+和O2存在下,通过甲虫荧光素的氧化反应发光(图1).在常规反应条件下,荧光素的氧化发生时,以荧光素-AMP作为中间体,转换非常缓慢.结果,在底物和酶混合后,测试化学产生"闪烁"的光,并迅速衰减.专利化的测试试剂,定量萤火虫荧光素酶活力,掺入了辅酶A(CoA),增强快速酶转换来提高反应动力学(5),导致持续的"闪烁"发光信号(图2).

　　图1由萤火虫和Renilla荧光素酶催化的生物发光

　　海洋腔肠荧光素酶,一个36kDa单亚基蛋白质,纯化自天然来源的Renillareniformis(6),含有3%的碳水化合物,但是和萤火虫荧光素酶一样,酶活力不需翻译后修饰,在翻译后即可作为遗传报告基因.海洋腔肠荧光素酶所催化的发光反应,利用O2和海样腔肠荧光素(coelenterazine)(图1).当用DLR测试化学作实验时,海洋腔肠荧光素酶反应的动力学产生闪烁型发光信号,在检测过程中缓慢地衰减(图2).

　　在DLR测试系统中,用单个裂解液分步测定萤火虫和海洋腔肠荧光素酶活力.在完成萤火虫荧光素酶活力("实验"报告基因)的测定后,萤火虫发光被快速湮灭,并同时激活海洋腔肠荧光素酶的发光反应("