用于基因工程的工具酶

　　一,限制性内切酶(Endonucleosase)

　　(一)限制性内切酶(Endonucleosase)的发现与分类

　　1)50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断,从而保证其不为外来噬菌体所感染,而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护,这种现象叫做限制-修饰,它们由三个基因位点所控制:hsdR,hsdM,hsdS,十年后,人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理:

　　hsdR---限制性内切酶

　　hsdM---限制性甲基化酶

　　hsdS---控制两个系统的表达

　　1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶,HindII和HindIII,为基因工程技术的诞生奠定了基础.

　　截止到目前为止,已经分离出400余种II类酶,搞清识别位点的有300种,商品化的约有一百种,而实验室常用的有二十种.

　　2)限制性核酸内切酶可分为三大类:

　　I类能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近切割双链,但切割序列没有专一性.

　　II类识别位点(回文序列)严格专一,并在识别位点内将双链切断

　　III类识别位点严格专一(不是回文序列),但切点不专一,往往不在识别位点内部.

　　因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶.

　　(二)II类限制性内切酶的命名及特性

　　命名原则:取属名的第一个字母大写,取种名的前两个字母小写,构成基本名称.该种中发现的不同的酶按照顺序编号I,II,III等.如存在变种和品系,取变种或品系的一个字母.若酶存在于质粒上,则需大写字母表示非染色体遗传因子.

　　如,HindIII从HaemophilusInfluenzued株中分离的第三个酶.EcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗药性R质粒上.

　　(三)II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点

　　绝大多数的II类限制性内切酶在底物DNA上的识别顺序长度为4,5,6碱基对,这些碱基对的顺序呈回文结构(Palindromic),而且切点就在其内部,如EcoRI5'-GAATTC-3'.

　　DNA被限制性内切酶切开之后,呈现两种断口:

　　钝端(平端)如PvuII,AluI,EcoRV等

　　粘端(粘性末端)如:EcoRI等

　　图2-1限制性内切酶产生的末端

　　(四)识别位点在DNA分子中的频率

　　对于特定的限制性酶在DNA分子中的识别位点数目是可以计算的,四碱基的酶平均大约每256个核苷酸(44)有一个识别位点,而六碱基的酶大约4096(46)个核苷酸有一个识别序列,计算是在假定核苷酸随机排列的情况下进行的.实践中这种方法不完全正确,如λDNA长49kb,对于六碱基的酶应该有12个切割位点,实际上要少一些,如BglII只有6个,BamHI只有5个,而SalI只有2个.

　　二,甲基化酶

　　在专一位点上甲基化,与限制性内切酶相对应.

　　(一)大肠杆菌中的甲基化酶

　　dam甲基化酶:可在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基,这样可使一些识别顺序中含有5'GATC3'的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如BclI(TGATCA),但BamHI(GGATAA)则不会因为N6A的甲基化而失去活性,因为这两种酶对底物的特异性不同.

　　dcm甲基化酶此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基,受其影响的限制性内切酶是EcoRII.

　　(二)甲基化酶在基因工程中用途

　　许多II类限制性内切酶,都存在着相对的甲基化酶,它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上,封闭酶切位点,从而使其免受切割.如:M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上,从而使DNA免受EcoRI的切割.

　　三,T4-DNA连接酶(T4-DNALigase)

　　来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌,连接修复3'端羟基和5'端磷酸基因,脱水形成3'-5'磷酸二酯键

　　连接双链DNA上的单链缺口(Nick),因此亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端

　　连接RNA模板上的DNA链缺口

　　连接平头双链DNA速度很慢,在高浓度的底物和酶的作用下方可进行,这属于分子之间的连接.

　　图2-2连接酶的作用方式

　　四,核酸酶

　　作用:降解磷酸二酯键

　　分为:外切酶内切酶

　　(一)Bal31(来自于细菌Alteromonasespejiana)单链特异的核酸内切酶活性,双链特异的内切酶活性.依赖于Ca2+

　　用途:

　　构建限制酶图谱

　　产生末端缺失突变

　　DNA超螺旋线性化

　　(二)E.coli外切酶III

　　只降解DNA分子的一条链,产生单链的DNA分子.

　　(三)S1核酸酶(来源于米曲霉菌)

　　特性:

　　1.降解单链DNA或RNA,降解DNA的速度大于降解的速度

　　2.降解发生的方式为内切和外切

　　3.酶切活性需4.0-4.5pH环境,Zn2+激活

　　4.酶量过大时会降解双链核酸,因为双链降解活性比单链低75000倍

　　(四)DNaseI:来自于牛胰腺,既可以降解单链也可以降解双链,没有特异性,产生单核苷酸或短链

　　五,聚合酶

　　(一)DNA聚合酶I

　　5'-3'聚合酶活性

　　3'-5'外切酶活性

　　5'-3'外切酶活性

　　核酸内切酶活性

　　可以被枯草杆菌蛋白酶水解成:Klenow片段和N端具5'-3'外切酶活性的分子.

　　图2-3DNA聚合酶I

　　(二)Klenow酶

　　该酶无5'-3'外切活性,保留了5'-3'聚合活性及3'-5'外切活性,基因工程中利用该酶:

　　修复限制性内切酶造成的5'突出的粘性末端

　　标记DNA探针

　　催化cDNA第二条链的合成

　　末端终止法测序

　　图2-4Klenow酶的作用方式

　　(三)T4DNA聚合酶

　　与Klenow酶相似,外切酶活性更高.体外诱变反应中效率很高.