限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）:识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶.

　　[别名]Endodeoxyribonuclease

　　[酶反应]限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上.它能识别外源DNA并将其降解.

　　[单位定义]在指明pH与37℃,在0.05mL反应混合物中,1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位.

　　[性状]制品不含非专一的核酸水解酶(由10单位内切酶与1μgλDNA,保温16小时所得的凝胶电泳图谱的稳定性表示).

　　限制性核酸内切酶的命名；一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成,第四个字母表示菌株(品系).例如,从BacillusamyloliquefaciensH中提取的限制性内切酶称为BamH,在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶,可以编成不同的号,如HindII、HindIII,HpaI、HpaII,MboI、MboI等.

　　在生物体内有一类酶,它们能将外来的DNA切断,即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力,但对自己的DNA却无损害作用,这样可以保护细胞原有的遗传信息.由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的,故名限制性内切酶(简称限制酶).限制酶是基因工程中所用的重要切割工具.科学家已从原核生物中分离出了许多种限制酶,并且已经商品化,在基因工程中广泛使用.根据限制酶切割的特点,可将它们分为两大类：一类是切割部位无特异性的；另一类是可特异性地识别核苷酸序列,即只能在一定的DNA序列上进行切割.这种能被特异性识别的切割部位都具有回文序列,也就是在切割部位,一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致.在基因工程中使用的多数是后一类酶.限制酶在特定切割部位进行切割时,按照切割的方式,又可以分为错位切和平切两种.错位切一般是在两条链的不同部位切割,中间相隔几个核苷酸,切下后的两端形成一种回文式的单链末端,这个末端能与具有互补碱基的目的基因的DNA片段连结,故称为黏性末端.这种酶在基因工程中应用最多.另一种是在两条链的特定序列的相同部位切割,形成一个无黏性末端的平口.

　　在基因操作过程中,除了限制酶以外,还要用一系列的酶类,才能完成全过程.例如,碱性磷酸酯酶、DNA多聚酶、末端转移酶、多核苷酸酶、逆转录酶等.这些酶都有各自特殊的催化功能,现在都有商品出售,可以根据不同的需要选用.

　　简短定义：

　　DNA限制性内切酶：

　　生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶.它可以将外来的DNA切断的酶,即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力,但对自己的DNA却无损害作用,这样可以保护细胞原有的遗传信息.由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的,故名限制性内切酶(简称限制酶).

　　限制性内切酶综述

　　(RestrictionEndonucleases:AnOverview)

　　30多年前,当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时,首次发现了限制性内切酶.细菌可以抵御新病毒的入侵,而这种"限制"病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶.首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoRI和EcoRII,以及来源于Haemophilusinfluenzae的HindII和HindIII.这些酶可在特定位点切开DNA,产生可体外连接的基因片段.研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具.

　　当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候,以NEB为代表的许多公司开始寻找更多的限制性内切酶.除了某些病毒以外,限制性内切酶只在原核生物中被发现.人们正在从数以千计的细菌及古细菌中寻找新的限制性内切酶.而对已测序的原核基因组数据分析表明,限制性内切酶在原核生物中普遍存在--所有自由生存的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶.

　　限制性内切酶的形式多样,从大小上来说,它们可以小到如PvuII（157个氨基酸）,也可以比1250个氨基酸的CjeI更大.在已纯化分类的3000种限制性内切酶中,已发现了超过250种的特异识别序列.其中有30%是在NEB发现的.对具有未知特异识别序列的限制性内切酶的研究发现工作仍在继续.人们从分析细胞提取物的生化角度研究的同时,也采用计算机分析已知的基因组数据,以期有更多的发现.尽管很多新发现的酶的识别序列与已有的重复--即同裂酶,仍然有识别新位点的酶不断被发现.

　　上世纪80年代,NEB开始克隆并表达限制性内切酶.克隆技术由于将限制性内切酶的表达与原有细胞环境分离开来,避免了原细胞中其它内切酶的污染,从而提高了酶的纯度.此外,克隆技术提高了限制性内切酶的产量,简化了纯化过程,使得生产成本显著降低；克隆的基因很容易进行测序分析,表达出的蛋白也能进行X射线结晶分析,这使得我们对于克隆产物更加确定.

　　限制性内切酶一、限制与修饰（Restrictionandmodification）

　　1．限制与修饰现象

　　早在50年代初,有许多学者发现了限制与修饰现象,当时称作寄主控制的专一性（hostcontrolledspecificity）.l噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性,其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题（表2-1）.l在感染某一宿主后,再去感染其它宿主时会受到限制.

　　E.coli菌株λ噬菌体感染率

　　lKlBlC

　　E.coliK110-410-4

　　E.coliB10-4110-4

　　E.coliC111

　　说明K和B菌株中存在一种限制系统,可排除外来的DNA.10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果,此时限制系统还未起作用.而在C菌株不能限制来自K和B菌株的DNA.限制作用实际就是限制酶降解外源DNA,维护宿主遗传稳定的保护机制.甲基化是常见的修饰作用,可使腺嘌呤A成为N6甲基-腺膘呤,胞嘧啶C成为5'甲基胞嘧啶.通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的.

　　2．限制酶的发现

　　在20世纪60年代,人们就注意到DNA在感染宿主后会被降解的现象,从而提出限制性切酶和限制酶的概念.1968年,首次从E.coliK中分离到限制酶,它有特定的识别位点但没有特定的切割位点,其中切割位点离识别位点达1000bp以上.

　　1970年,美国约翰·霍布金斯大学的H.Smith于偶然中发现,流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA,其细胞提取液可降解E.coliDNA,但不能降解自身DNA,从而找到HindⅡ限制性内切酶.HindⅡ限制性内切酶位点和切割位点如下：

　　5'…GT