见http://zhidao.baidu.com/question/292063616.html或

　　镍柱分离纯化

　　固定金属离子亲和柱主要用于金属螯化离子.位于许多蛋白中的组氨酸残基将会和许多金属离子,例如锌.铜,镍,铁等形成复合物.因此,该柱料能选择性螯合一些具有组氨酸残基的蛋白质.但是半胱氨酸和咯氨酸残基也能和固定化金属螯和.但是亲和力比组氨酸要弱.所以,结合的强度是和缓冲液的PH和金属离子决定的.

　　金属螯和柱料主要是由亚氨基的乙酰乙酸成分耦联琼脂糖柱料,借助醚长生7个原子的空间.

　　全部容量：24-30um的含有zn的干胶

　　柱料结构：6%的高铰链的琼脂糖

　　柱料大小：45-165um

　　平均微粒：90um

　　直流速度：25度/0.1MPa/30倍柱床/5厘米高度/每小时可达700厘米

　　最大压强：0.3MPa

　　PH变化：长期3-13

　　短期2-14

　　化学稳定：通用含水缓冲液

　　0.01M盐酸,1.0MNAOH,20%乙醇（保存7天）

　　物理性质：可以忽略在PH或者离子变化下的体积变化

　　耐热性能：121度下0.1M乙酸钠作用半小时

　　金属螯和柱料保存于事先填充于20%乙醇.所以要搅拌驱除20%乙醇溶液.换成去离子水.比例是25%去离子水和75%处理胶.

　　处理金属螯和柱料：

　　1平衡所有用到的材料于室温.

　　2搅拌金属螯和柱料

　　3倒水进柱子,驱除气体.用无离子水液封几厘米.

　　4将金属螯和柱料连续倒进柱子,用玻璃棒支撑柱壁防止气泡形成.

　　5然后立即用无离子水液封,装上柱盖,连接上泵.

　　6打开柱子底部的开关,然后调节泵的流速.通常是不超过0.3MPa的.

　　7经过一个稳定的柱床填鸭后,维持填压速度为3个柱床.

　　使用adaptor

　　1经过上溯填鸭后,关闭柱床下面开关,移开上面的薄膜,小心的加上去离子水进行液封.

　　2一定角度插入adaptor,确保没有气泡.

　　3确保所有的连接都没有问题,柱子/泵/样品接受器

　　4倾斜插入活塞确保没有气泡和管道充满液体.利用活泵正反向的流动确保没有气泡.

　　5固定adaptor,打开柱子开关,开始缓冲液的流动.先以填鸭的速度直到柱床稳定后.

　　固定金属离子：

　　金属螯和柱料通过水来螯和金属的,避免发生沉淀在胶上.

　　1确保柱子已经平衡好.如果有必要可以洗2个柱床（去离子水）

　　2选择金属离子和0.1-0.3M中弱性酸.例如铁离子PH3左右就好,避免形成沉淀和共沉.

　　3加入一倍柱床的金属离子溶液

　　45倍柱床的去离子水洗涤

　　5至少2倍柱床的平衡缓冲液

　　结合：

　　发生于PH5.5-8.5之间.最强反映发生于最后

　　初始缓冲液的选择决定于金属离子和样品的结合性质.乙酸钠或者磷酸钠是比较好的缓冲液中不能使用EDTA或者柠檬酸盐

　　最通用缓冲液：

　　0.01-0.2M磷酸钠

　　0.05M乙酸钠

　　强烈推荐加入0.15-0.5MNaCl用于防止离子交换.

　　通常如果不知道一个蛋白的结合能力,最好的就是使用锌离子和中性的磷酸或者乙酸盐,同时含有0.15-0.5MNaCl

　　去垢剂不会影响蛋白质的结合能力

　　金属离子的取代意味着蛋白发生了结合.这种现象可以通过颜色来决定

　　洗脱蛋白：（3种方法）

　　1降低PH(一步或者分步),大部分蛋白溶解于PH4-6最终3-4是可容的.可选择柠檬酸盐,磷酸或者乙酸盐.

　　2逐步提高咪唑的浓度（0-0.5M）,梯度变化最好是在初始缓冲液的PH范围.

　　3加入EDTA或者EGTA可洗脱蛋白质.但是不是通用的.

　　利用离心或者重力作用纯化组氨酸位点蛋白

　　通过上镍进行选择性结合含有组氨酸位点蛋白,然后利用含有咪唑的缓冲液洗脱蛋白.

　　以下的实验是为了最大化将组氨酸位点蛋白结合到金属螯和柱料,然后确保能够洗脱下来.当结合和洗脱的条件尚未明了时,这些方法也是很好用的.

　　为了获得高纯度的蛋白,必须摸索咪唑的缓冲液在样品上柱和洗脱时的浓度.通常使用10mM-500mM范围的咪唑的缓冲液进行剃度洗脱,然后通过收集和SDS-PAGE蛋白电泳确定洗脱浓度.

　　为了纯化不可容的含有his位点的蛋白质,（包含体）,可以在变性条件下进行.利用8M尿素或者6M盐酸呱进行溶解蛋白.

　　样品处理：

　　样品要经可能溶解,避免出现堵塞现象,所以可以利用0.45uM虑膜过滤杂志

　　如果样品时溶解于20mM磷酸缓冲液中（含有0.5MNacl,PH7.4）,必须调整PH到7－8.

　　上柱前准备：

　　洗柱料：

　　1亲柔震动胶瓶充旋胶料

　　2利用吸管吸出足量柱料用以纯化目的.每毫升柱料可以吸纳5毫克蛋白

　　3500g离心2－5分钟,沉淀柱料.

　　4小心去除上清

　　5加入5倍体积去离子水,充分振荡柱料.可以倒置来回5分钟,不要机械搅拌.

　　6再次500g离心2－5分钟,沉淀柱料.

　　7再次小心去除上清

　　挂镍：

　　1加入0.5倍柱床体积0.1M硫酸镍,充分振荡柱料.可以倒置来回5分钟,不要机械搅拌.

　　2500g离心2－5分钟,沉淀柱料.

　　3小心去除上清

　　洗柱：

　　1加入5倍体积去离子水,充分振荡柱料,来回倒置5分钟

　　2500g离心2－5分钟,沉淀柱料.

　　3小心去除上清

　　4再洗两次柱料（一共3×5柱床去离子水）

　　5最后用一倍体积起始缓冲液充旋柱料（20mMNa2HPO4/0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）

　　利用离心来纯化：

　　上样：

　　1在起始缓冲液中加入样品,然后使整体胶浓度达到50％

　　2亲柔搅拌,室温离心5－30分钟,结合能力取决于蛋白和样品浓度.

　　3500g离心2－5分钟,沉淀柱料.

　　4取

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