一淀粉水解试验

　　（一）实验原理

　　细菌对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用,必须靠产生的胞外酶,如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶将大分子物质分解.胞外酶能分泌扩散到细胞外,将物质分解成小单位如糖、氨基酸、甘油与脂肪酸.这些小单位的物质能被细菌吸收和利用.水解过程可通过底物的变化来证明,如细菌水解淀粉的区域,用碘测定不再产生蓝色；水解明胶可观察到明胶被液化；脂肪水解后产生脂肪酸改变培养基的pH,其中的中性红指示剂使培养基从淡红色变为深红色.

　　（二）实验方法

　　将淀粉培养基溶化后,冷至45℃左右,以无菌操作制成平板.

　　取18-24h的纯培养物点于平板上,每皿可点种3-5个菌株,适温培养2-4d,形成菌落后,在平板上滴加卢戈氏碘液,以铺满菌落周围为度,平板成蓝色.如果菌落周围有无色透明圈出现,说明淀粉已经被水解,实验为阳性,否则为阴性.透明圈的大小一般说明水解淀粉的能力.

　　（三）实验试剂的配制

　　肉汤蛋白胨琼脂成分：蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化钠5g,琼脂17g,蒸馏水1000mL,pH7.2.

　　淀粉培养基制法：在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2％的可溶性淀粉,校正pH值至7.6,分装三角瓶,121℃20min灭菌备用.

　　卢戈氏(Lugol)碘液：碘片1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml,先将碘化钾溶解在少量水中,再将碘片溶解在碘化钾溶液中,混匀,定容.

　　二糖发酵试验

　　(一)实验原理

　　单糖发酵是将葡萄糖,乳糖或麦芽糖等分别加入蛋白胨水培养基内,使其最终浓度为0.75-1％.并加入一定量酚红指示剂及小倒管,制成单糖发酵管,接种细菌经37℃培养18-24小时,若能分解糖产酸则酚红指示剂由红变黄,若能分解甲酸有CO2和H2等气体形成,小倒管内则聚集有气泡；不分解,则指示剂不变色.

　　(二)实验材料

　　1．菌种：大肠杆菌,伤寒杆菌18-24小时琼脂斜面培养物.

　　2．培养基：葡萄糖发酵管,乳糖发酵管等.

　　(三)实验方法

　　1．将伤寒杆菌,大肠杆菌按照液体接种方法分别接种于葡萄糖及乳糖发酵管内.

　　2．置37℃孵箱培养18-24小时.

　　3．观察结果：由于一些细菌能分解某种糖类产酸,所以培养基中pH下降到7.0以下,在酚红指示剂的显示下,培养基颜色由红变黄.产酸者以“+”表示,如果同时产生气体,则培养基中小倒管内有气泡出现,此乃产酸又产气,以“♁”表示,不分解,则指示剂不变色,用“-”表示.

　　(四)实验结果

　　伤寒杆菌大肠杆菌

　　葡萄糖+♁

　　乳糖-♁

　　(五)实验试剂的配制

　　1.单糖发酵管的制备：成分：蛋白胨水培养基100ml,0.2%酚红1ml,所需糖（葡萄糖或乳糖）0.75-1g

　　制法：

　　（1）将上述成分溶化,混匀分装于内含有倒置小玻璃管的小试管中,每管约2ml,加塞.

　　（2）小倒管排气,灭菌（8-10磅,20-30分钟）,贮存备用.

　　用途：供单糖发酵试验用.

　　2.0.2%酚红配制法

　　酚红（phenolred）0.2g,0.lmol/LNaOH8ml,蒸馏水92ml

　　将酚红入研钵徐徐加入0.lmol/LNaOH研磨,再补足蒸馏水即成.若需长时间保存,可高压灭菌后贮存备用.

　　三甲基红（M.R）试验

　　(一)实验原理

　　某些细菌如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸,继而分解为甲酸、乙酸、乳酸等,使培养基pH值降至4.5以下,加入甲基红指示剂呈红色,此为阳性反应；若产酸量少或产生的酸进一步转化为醇、醛、气体和水等,则培养基的酸碱度仍在pH6.2以上,加入甲基红指示剂呈现黄色,为阴性反应.

　　(二)实验材料

　　1.菌种：大肠杆菌,产气杆菌18-24h琼脂斜面培养物.

　　2.培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基.

　　3.试剂：甲基红试剂.

　　(三)实验方法

　　1.分别将大肠杆菌,产气杆菌接种于两支葡萄糖蛋白胨水培养基中.

　　2.置37℃培养2-3天取出,分别滴加甲基红试剂2-3滴,混匀,观察结果.

　　(四)实验结果

　　大肠杆菌：+,产气杆菌：-.

　　(五)实验试剂的配制

　　1．甲基红试剂的配制

　　甲基红0.04g,95%酒精60ml,蒸馏水40ml.

　　先使甲基红溶解于酒精中,再加入蒸馏水,混合,摇匀即成.

　　2.葡萄糖蛋白胨水培养物

　　成分：蛋白胨5g葡萄糖5g

　　制法：

　　（1）将上述成分溶解于蒸馏水中.

　　（2）调节pH至7.6,用滤纸过滤除渣.

　　（3）分装中试管,每管约3-4ml,灭菌后备用.

　　用途：供甲基红及V-P试验用.

　　四产吲哚（indole）试验

　　(一)实验原理

　　某些细菌如大肠杆菌,变形杆菌等具有色氨酸酶,能分解蛋白胨水培养基中的色氨酸,产生靛基质（无色吲哚）,再与欧立希试剂（对二甲基氨基苯甲醛）反应,形成红色化合物—玫瑰吲哚,即为阳性反应.

　　(二)实验材料

　　1.菌种：大肠杆菌,伤寒杆菌18-24小时琼脂斜面培养物.

　　2.培养基：蛋白胨水培养基.

　　3.试剂,欧立希（Ehrlich）试剂（对二甲基氨基苯甲醛）

　　(三)实验方法

　　1.分别将大肠杆菌,伤寒杆菌接种于两支蛋白胨水培养基中.

　　2.置37℃培养2-3天后,每管沿管壁各加欧立希试剂0.5-1ml于培养液面上,待1-2分钟后观察结果：在交界面出现玫瑰红色环即为吲哚试验阳性,无红色环即为阴性.

　　(四)实验结果

　　大肠杆菌：+；伤寒杆菌：-.

　　(五)实验试剂的配制

　　1.蛋白胨水培养基的制备

　　成分：蛋白胨10g氯化钠5g蒸馏水1000ml

　　制法：

　　（1）先用少量蒸馏水将蛋白胨和氯化钠相混合溶解,再加足蒸馏水量.

　　（2）调节pH至7.6、用滤纸过滤.

　　（3）分装中试管,每管约3-4ml,加塞灭菌后备用.

　　2.欧立希（Ehrlich）试剂的配制

　　对位二甲基氨基苯甲醛4g