（一）实验原理

　　双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物.在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应.凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应.

　　紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量.测定范围为1-10mg蛋白质.干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等.

　　此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少.主要的缺点是灵敏度差.因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定.

　　（二）试剂与器材

　　1.试剂：

　　（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度.如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液.牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0．05NNaOH配制.

　　（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4&8226;5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6&8226;4H2O）,用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10%NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）.此试剂可长期保存.若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制.

　　2.器材：

　　可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等.

　　（三）操作方法

　　1.标准曲线的测定：取12支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂.充分摇匀后,在室温（20～25℃）下放置30分钟,于540nm处进行比色测定.用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液.取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光吸收值为纵座标绘制标准曲线.

　　2、样品的测定：取2～3个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度.注意样品浓度不要超过10mg/ml.