蛋白质含量测定方法比较

　　本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法.了解各种测定方法的基本原理和优缺点.

　　蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一.目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法（Bradford法）.其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10～20倍,比Biuret法灵敏100倍以上.定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质.

　　值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果.每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点.在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间.

　　考马斯亮蓝法（Bradford法）,由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用.

　　一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法

　　样品与浓硫酸共热.含氮有机物即分解产生氨（消化）,氨又与硫酸作用,变成硫酸氨.经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量.若以甘氨酸为例,其反应式如下：

　　CH2COOH

　　|+3H2SO4®2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)

　　NH2

　　2NH3+H2SO4®(NH4)2SO4(2)

　　(NH4)2SO4+2NaOH®2H2O+Na2SO4+2NH3(3)

　　反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成,反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行.

　　为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点.收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸.实验和计算方法这里从略.

　　计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白

　　氮即得.如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6．25即得.

　　五种蛋白质测定方法比较如下：

　　方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法

　　（Kjedahl法）灵敏度低,适用于0.2~1.0mg氮,误差为±2％费时

　　8～10小时将蛋白氮转化为氨,用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长双缩脲法（Biuret法）灵敏度低

　　1～20mg中速

　　20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋®紫色络合物硫酸铵；

　　Tris缓冲液；

　　某些氨基酸用于快速测定,但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏

　　50～100mg快速

　　5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；

　　各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正Folin－酚试剂法（Lowry法）灵敏度高

　　～5mg慢速

　　40～60

　　分钟双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；

　　Tris缓冲液；

　　甘氨酸；

　　各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；

　　颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高

　　1～5mg快速

　　5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其lmax由465nm变为595nm强碱性缓冲液；

　　TritonX-100;

　　SDS最好的方法；

　　干扰物质少；

　　颜色稳定；

　　颜色深浅随不同蛋白质变化

　　二、双缩脲法（Biuret法）

　　（一）实验原理

　　双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物.在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应.凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应.

　　H2O

　　O=CC=O

　　HNNH

　　R-CHCH-R

　　O=CCuC=O

　　HNNH

　　R-CHCH-R

　　H2O

　　紫色络合物

　　紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量.测定范围为1~10mg蛋白质.干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等.

　　此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少.主要的缺点是灵敏度差.因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定.

　　（二）试剂与器材

　　1.试剂：

　　（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度.如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液.牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0．05NNaOH配制.

　　（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O）,用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10%NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）.此试剂可长期保存.若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制.

　　2.器材：

　　可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等.

　　（三）操作方法

　　1.标准曲线的测定：取12支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂.充分摇匀后,在室温（20~25℃）下放置30分钟,于540nm处进行比色测定.用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液.取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光吸收值为纵座标绘制标准曲线.

　　2、样品的测定：取2~3个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度.注意样品浓度不要