黑胶虫

　　1、黑胶虫概况：

　　在细胞培养的时候,有时会在400倍显微镜下看到小黑点在动,小黑点有时呈点状,有时呈小的片状,运动形式为在原地振动（类似布朗运动）,这种小黑点既不是细菌、霉菌,也不是支原体（我们曾经请周守长用血平板培养过,没有菌落出现）,目前业内人士称其为“黑胶虫”.

　　黑胶虫到底是否为生物?这个一直是业内人士的疑惑.黑胶虫一般是存在血清里的,而血清通常是经过0.1μm滤膜过滤的,所以血清里不可能存在细菌、霉菌及支原体等微生物.如果说黑胶虫不是生物,它会不断增多,达到一定数量时会与细胞竞争性生长,与细胞竞争培养基中的营养,从而使得细胞营养不足而死亡.

　　不管对于黑胶虫的争论如何,但有几个是目前大家公认的：

　　①与细胞竞争性生长,对细胞生长有不利影响.

　　②“黑胶虫”会增殖,增殖多时,视野下一大片都为“黑胶虫”.

　　③“黑胶虫”与血清有关,与血清质量有很大关系.

　　2、目前对“黑胶虫”的定论：有2种解释：

　　第一,黑胶虫为生物.它是小于细菌的生物,直径小于0.1μm,大多国外血清中多见,可能是国外牛血清中含有的某种原虫.只要它是生物,那么在培养基中一定会对细胞有影响.

　　第二,黑胶虫不是生物.国内的血清中,通常灭活之后都会有絮状沉淀出现,而黑胶虫出现时,所使用的血清被反复冻融过多次.所以推测,所谓的“黑胶虫”其实就是血清中的某些蛋白成分的物质,经过灭活之后丧失活性,在培养基中,镜检见到的运动其实是这些物质在溶液中做“布朗运动”.随着细胞消耗培养基,这些物质越来越多,最后细胞所用的营养消耗完,细胞容易死亡.

　　3、对于“黑胶虫”的处理方法：

　　首先,血清买回来灭活前冻融应逐级冻融,即按照-20℃——4℃完全融化后,再置入水浴中,与室温一起升高到56度,这样的目的是避免温度骤变,导致血清中的营养物质丧失活性.

　　第二,血清灭活后分装保存.按照每次用血清的量分装,尽量减少血清冻融的次数.分装时注意无菌.

　　第三,细胞培养时血清浓度稍大一些.通常细胞培养血清浓度为10%-15%,但如果血清冻融次数过多,那营养物质丧失活性,按15%的浓度配制事实上达不到15%的营养成分,故培养基配置时一般用18%-20%的血清.

　　这种黑胶虫,在国外称其为-纳米细菌,现将我看到的一些资料转述如下,希望对大家有所帮助：

　　1.纳米细菌的发现

　　芬兰的一个科学家Ciftciogluetal在其细胞培养过程中,发现在胎牛血清中存在一种直径50-500nm的微粒;这种颗粒物对伽玛射线具有很强的耐受性;针对包括支原体在内的所有已知微生物的特异性检测实验均为阴性;这种颗粒物在血琼脂培养基以及支原体培养基中无法生长,通常的细菌染色方法难以着色.因此,Kajander判定这是一种新的微生物,根据其体型微小并且栖息在血液中的特点,将其命名为Nanobacteriumsanguineum,简称Nanobacteria,中文译名纳米细菌,并将菌种保存于德国微生物存储中心(DSMNo:5819-5821,theGermanCollectionofMicro-organisms,Braunschweig,Germany).

　　2纳米细菌的生物学特性

　　2.1纳米细菌——哺乳动物体内最小的细菌细胞培养时所使用的血清通常采用过滤法达到无菌的目的,通常采用直径0.1μm的滤膜过滤除菌.Kajander研究发现,0.1μm

　　的滤膜过滤并不能有效地清除血清中的纳米细菌,但是血清经过0.05μm的滤膜过滤则能有效清除纳米细菌污染.细胞培养条件下的纳米细菌经过0.2μm的滤膜过滤后约有3%的纳米细菌可以通过滤膜,而在加压过滤的情况下,约有50%的纳米细菌可以通过0.2μm的滤膜.刚刚经过过滤的纳米细菌在相差显微镜下无法发现,但在不含血清添加剂的细胞培养液中培养24h后,即可以用相差显微镜观测到.电子显微镜观察显示,纳米细菌的平均直径为200nm,而子代纳米细菌的最小直径仅50nm.传统的观点认为,只有当细胞直径在不低于140nm时,才能维持其最基本的新陈代谢.Kajander认为,纳米细菌可能是地球形成早期、在原始大气条件下的一种最原始的生命形式,因此不能用衡量已经经过几十亿年进化的生命形式的观点去衡量这种古老的生命形式,并且推测,纳米细菌遭受不良因素的侵害后可以形成许多的体形微小的碎片,并将其释放到环境中,每一个碎片都可能携带部分遗传信息,在特定条件下,这些"基本"颗粒聚集在一起形成群落,当足够数量的"基本"颗粒提供完整的遗传信息时,则可以形成新的纳米细菌.

　　2.2纳米细菌缓慢的增殖周期

　　微生物学家通常是通过对某种微生物进行培养,进而了解该种微生物的特性.然而,并非每种微生物都是可以在实验室中进行培养的,主要原因在于这些微生物的培养条件我们并不清楚,其生存环境以及是否与其他微生物存在共生关系我们并不十分了解.纳米细菌就是一种对生长环境要求非常苛刻的微生物,其新陈代谢率极为缓慢,仅为普通细菌的1/10000.研究发现,纳米细菌主要利用环境中的氨基酸而不是葡萄糖来提供能量,谷氨酰胺、天冬酰胺以及精氨酸均可被其利用.在37℃有50-10mL/L的二氧化碳及900-950mL/L的空气存在的潮湿环境下,并且在含有100mL/L胎牛血清和适量谷氨酰胺的pH值7.4的细胞培养基中,纳米细菌能够缓慢生长,平均倍增时间为3d,而在无血清的细胞培养基中,其增殖速度变慢,细菌倍增时间可延长至5-6d,在添加适量促纳米细菌生长因子BGF(一种杆菌培养上清的超滤液)或N3(纳米细菌培养上清的超滤液)的条件下,其增殖速度加快,倍增时间可缩短至0.6-1d.在有促纳米细菌生长因子BGF存在的条件下,纳米细菌甚至可以在固体培养基中生长,并形成直径lmm大小的细菌集落.

　　2.3纳米细菌独特的生物矿化现象

　　当在含血清的培养基中培养的纳米细菌被转移至不含血清的培养基中继续培养时(DMEM或RPMI-1640),在1a之内就可以观察到纳米细菌出现贴壁现象,在1wk之内,就可以在纳米细菌的周围形成几微米厚的生物被膜(biofilm),并且紧紧贴附于培养瓶底部,而纳米细菌栖息其中(这与在含血清培养基中培养的纳米细菌的形态明显不同),此时其大小接近于一个酵母细胞,2-3wk以后,由于生物被膜的增厚,其直径已近似于一个红细胞的大小.用EDX法对这种生物被膜的化学组成进行分析,显示其钙磷的峰值与羟基磷灰石极其相似,电子显微镜观察以及傅立叶转换红外频谱(fouriertransformIRspectroscopy,FTIR)分析显示其主要成分为碳酸羟基磷灰石(carbonatehydroxyapatite),而且,不论在有无血清作为添加剂的情况下,都可以见到这种被羟基磷灰石包绕的纳米细菌,这种