运用凯氏定氮法

　　凯氏定氮法

　　原理

　　蛋白质是含氮的有机化合物.食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵.然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量.

　　1.有机物中的胺根在强热和CuSO4,浓H2SO4作用下,硝化生成（NH4）2SO4

　　反应式为：

　　2NH2+H2S04+2H＝(NH4)2S04（其中CuSO4做催化剂）

　　2.在凯氏定氮器中与碱作用,通过蒸馏释放出NH3,收集于H3BO3溶液中

　　反应式为:

　　(NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4

　　2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O

　　3.用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定,根据HCI消耗的量计算出氮的含量,然后乘以相应的换算因子,既得蛋白质的含量

　　反应式为：

　　(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3

　　(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3

　　[编辑本段]2试剂

　　所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制.

　　2.1硫酸铜.

　　2.2硫酸钾.

　　2.3硫酸.

　　2.42%硼酸溶液.

　　2.5混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合.也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合.

　　2.640%氢氧化钠溶液.

　　2.70.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液.

　　[编辑本段]3仪器

　　定氮蒸馏装置：如图所示.

　　凯氏定氮法仪器1.安全管

　　2.导管

　　3.汽水分离管

　　4.样品入口

　　5.塞子

　　6.冷凝管

　　7.吸收瓶

　　8.隔热液套

　　9.反应管

　　10.蒸汽发生瓶

　　[编辑本段]4操作方法

　　1、样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg）,移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中,加入0.2g硫酸铜,6g硫酸钾及20毫升硫酸,稍摇匀后于瓶口放一小漏斗,将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上,小火加热,待内容物全部炭化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色澄清透明后,再继续加热0.5小时.取下放冷,小心加20ml水,放冷后,移入100ml容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用.取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验.

　　2、按图装好定氮装置,于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,加入数粒玻璃珠以防暴沸,用调压器控制,加热煮沸水蒸气发生瓶内的水.

　　3、向接收瓶内加入10ml2%硼酸溶液及混合指示剂1滴,并使冷凝管的下端插入液面下,吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室,并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内,塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞.将10ml40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯,提起玻璃塞使其缓慢流入反应室,立即将玻璃盖塞紧,并加水于小玻璃杯以防漏气.夹紧螺旋夹,开始蒸馏,蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内,蒸馏5min.移动接收瓶,使冷凝管下端离开液皿,再蒸馏1min,然后用少量水冲洗冷凝管下端外部.取下接收瓶,以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点.

　　同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作.

　　计算：

　　X=(（V1-V2）*N*0.014)/(m*（10/100）)*F*100%

　　X：样品中蛋白质的百分含量,g；

　　V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积,ml；

　　V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积,ml；

　　N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；

　　0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；

　　m：样品的质量（体积）,g（ml）；

　　F：氮换算为蛋白质的系数.蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%,按16%计算乘以6.25即为蛋白质,乳制品为6.38,面粉为5.70,玉米、高粱为6.24,花生为5.46,米为5.95,大豆及其制品为5.71,肉与肉制品为6.25,大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83,芝麻、向日葵为5.30.

　　[编辑本段]注意事项

　　（1）样品应是均匀的.固体样品应预先研细混匀,液体样品应振摇或搅拌均匀.

　　（2）样品放入定氮瓶内时,不要沾附颈上.万一沾附可用少量水冲下,以免被检样消化不完全,结果偏低.

　　（3）硝化时如不容易呈透明溶液,可将定氮瓶放冷后,慢慢加入30%过氧化氢（H2O2）2-3ml,促使氧化.

　　（4）在整个消化过程中,不要用强火.保持和缓的沸腾,使火力集中在凯氏瓶底部,以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下,使氮有损失.

　　（5）如硫酸缺少,过多的硫酸钾会引起氨的损失,这样会形成硫酸氢钾,而不与氨作用.因此,当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时,要增加硫酸的量.

　　（6）加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点,硫酸铜为催化剂,硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂.

　　（7）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈红色.如果没有溴甲酚绿,可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液.

　　（8）氨是否完全蒸馏出来,可用PH试纸试馏出液是否为碱性.

　　（9）吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸,过剩的酸液用0.01N碱液滴定,计算时,A为试剂空白消耗碱液数,B为样品消耗碱液数,N为碱液浓度,其余均相同.

　　（10）以硼酸为氨的吸收液,可省去标定碱液的操作,且硼酸的体积要求并不严格,亦可免去用移液管,操作比较简便.

　　（11）向蒸馏瓶中加入浓碱时,往往出现褐色沉淀物,这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应,生成氢氧化铜,经加热后又分解生成氧化铜的沉淀.有时铜离子与氨作用,生成深l蓝色的结合物[Cu(NH3)4]2+

　　（12）这种测算方法本质是测出氮的